从兽医角度，这是终极研究证据，因为使用狗作为损伤模型，证明氢水治疗有利于皮肤损伤的修复。当然这种研究对于人类医学来说，只能属于动物实验层次。

本研究探讨了饮用富氢水对犬皮肤伤口愈合的影响。对每只犬的8个圆形伤口进行分析。实验组用富氢水处理，每天3次，对照组用蒸馏水处理。对犬创面组织进行组织病理学检查。用相应试剂盒检测创面皮肤匀浆中成纤维细胞、炎症细胞浸润、新生血管平均数量、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)活性。采用实时荧光定量法检测Nrf-2、HO-1、NQO-1、VEGF、PDGF的表达。我们观察到，与蒸馏水相比，富氢水伤口的愈合率更高，平均愈合时间更快。组织病理学显示，富氢水组的表皮平均厚度明显低于蒸馏水组，平均血管数高于蒸馏水组。蒸馏水组MDA水平高于富氢水组，SOD水平低于富氢水组。qRT-PCR结果显示，两组间各基因表达均有显著差异。富氢水处理可促进犬皮肤创面愈合，加速创面上皮化，减少炎症反应，刺激创面愈合相关细胞因子的表达，缩短创面愈合时间。

1.介绍

作为动物最大的器官，皮肤在防止动物致病微生物和创口方面起着至关重要的作用。由各种因素引起的皮肤伤口通常需要临床兽医处理。严重创伤的恢复与多种因素有关，如治疗时间和治疗策略等，可能导致不同的治疗效果，影响伤口愈合的时间和效果。创面愈合涉及炎症反应、氧化应激等一系列机制，在创面病理生理中起着重要作用。许多治疗方法已用于临床治疗，包括光动力治疗、远红外治疗、脂肪组织提取治疗和精氨酸基材料治疗，以及基于抗炎治疗策略的各种生物材料。

有研究报道，氢气可以通过抗氧化作用发挥治疗作用。氢气具有最低的分子量，同时具有强大的抗氧化能力，从体内清除过量的活性氧物种(氧自由基)。1975年，DoleM发现高压氢气可以有效治疗恶性皮肤肿瘤。临床研究表明，氢疗法在治疗类风湿性关节炎、糖尿病、帕金森病和代谢综合征方面具有潜在的治疗潜力。Tomohiro等发现，氢分子可通过诱导HO-1等Nrf-2下游基因，激活Nrf-2抗氧化防御通路，改善高氧诱导的肺损伤。一些研究表明，吸入含氢气体是临床护理的新指南，重点是皮肤伤口的治疗。

氢气是易燃易爆气体，危险且难以储存。然而氢饱和水，即所谓的富氢水，安全且容易吸收，经常用于医学。据报道，富氢水具有抗氧化和抗炎作用，降低促炎细胞因子水平，有效保护器官免受损伤。羟基自由基和过氧亚硝酸盐(ONOO-)离子具有很强的氧化毒性，并可引起脂质过氧化、DNA损伤和蛋白质过氧化，导致细胞损伤。然而，溶解在水中的氢可以与它们发生反应，减少了随之而来的损害。当氢气进入体内并与自由基发生反应，只产生水，排出多余的氢气。这意味着氢水可以安全地用于治疗疾病而不会产生副作用。

以往的动物实验研究均采用口服富氢水和注射富氢盐水(HRS)作为氢气主要给药途径。研究表明，富氢盐水可以通过上调血红素加氧酶(HO-1)的表达以及降低奎宁(NQO-1)来清除过氧化氢和活性氧(ROS)。此外，最近研究已经证明富氢水在动物和人类中的抗疲劳作用。富氢水还能诱导心肌细胞的抗凋亡作用，抑制大鼠肾组织中α、β-二羰基化合物和ROS的产生。另一项研究提示，使用富氢水可提高腭部创面恢复率。因此，富氢水已被证明是伤口治疗的基本治疗策略之一。尽管富氢水已被证明可以加速皮肤创伤的恢复，促进大鼠放疗引起的皮肤损伤的愈合，但关于富氢水在犬皮肤创伤中的应用的信息很少。

在此，我们旨在探索富氢水是否能在犬模型皮肤伤口的恢复中发挥重要作用。这是第一个以兽医研究为基础的研究，目的是评估富氢水对狗皮肤伤口愈合的影响。目的:(1)比较富氢水与蒸馏水处理犬开放性伤口的愈合效果;(2)比较氧化应激和炎症指标水平;(3)探讨富氢水对犬皮肤创面恢复是否有治疗价值。我们推测，富氢水可促进血管生成和提高组织抗氧化基因表达，从而促进创面愈合，加快创面愈合速度，使其成为一种安全有效的临床治疗方法。

2.材料和方法

2.1狗

12只健康雄性小猎犬(年龄:2-4岁;体重:9.0-11.3公斤)，在标准环境下饲养，并随时提供标准的狗粮和水。麻醉前6小时停止进食和饮水。所有方法均符合《中华人民共和国动物伦理程序和指南》要求的良好动物规范。我们尽一切努力减少动物的痛苦，减少动物的数量。本研究未报告死亡病例，犬的精神状态和饮食均正常。实验结束后，所有动物均未被宰杀，所有犬均健康，均被动物保护组织收养。

2.2手术创口的形成

实验犬随机分为对照组和实验组(n=6)。第0天在躯干背外侧剪毛。置头静脉置管，采用异丙酚(0.65mg/kg)麻醉，气管插管吸入3.5%异氟醚，术中实时监测实验犬的生理状态。

图1损伤部位编号。

使用真皮活检穿孔机在剃过的背部中线两侧各创建四个直径为15毫米的圆形伤口。每个创面距离背中线20mm，相邻创面距离25mm。从尾部到头部，从左侧到右侧分别标记为A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4(图1).术前24小时皮下注射美洛昔康0.1mg/kg，术后立即注射。每只狗都被关在一个笼子里，戴着伊丽莎白时代的项圈。创面每日用碘伏消毒。氢气(99.99%,v/v)，由氢气发生器(QL-500;以500mL/min的速度将其冲入400mL蒸馏水中10min达到饱和。术后所有犬只均可自由进食标准食物;对照组给予蒸馏水(400mL)，每日3次;试验组给予饱和富氢水(400mL)，每日3次。每只狗每次只喝一小时的水以保持富氢水浓度不变，另一段时间则不喝水。

在手术、插管、类似镇静和监测后7、14、21和28天收集皮肤创面样本;手术方式与皮肤创面模型相同，皮肤采用低张力缝合。手术部位每日用碘伏消毒。第7天取A1、B1处创面;第14天取样A2和B2，第21天取样A3和B3，第28天取样A4和B4。所有的样本都是用手术刀提取的。取样后，用缝线缝合伤口，用碘伏消毒。将A1、A2、A3和A4样品固定在4%的多聚甲醛中(20g多聚甲醛粉溶解在500mLPBS缓冲液中，然后用磁力搅拌器持续搅拌。用氢氧化钠调节溶液pH)。B1、B2、B3、B4样品置于−80℃冰箱中保存。

2.3.皮肤伤口检查

分别于术后7、14、21、28d观察富氢水组和蒸馏水组创面出血情况。观察包括有无出血，炎症渗出物特征，伤口愈合，有无伤口感染。在第3、7、14和21天拍摄伤口，并使用ImageJ软件对伤口进行量化。

创面愈合率=(S0−Sn)÷S0×100%

Sn:7、14、21、28天创面面积，S0:0天创面面积。

测量犬皮肤创面愈合情况，直至创面完全被肉芽组织覆盖;这个过程的时间就是伤口愈合的时间。

石蜡切片用于组织病理学检查。H&E染色用于评价上皮厚度和新生血管，Masson染色用于胶原纤维。简单地说，从每只狗中选择5个部分，并从每个部分的不同区域随机选择10个视野。切片评估由两名独立的盲法观察员进行。

氧化应激检测采用皮肤组织丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平，检测试剂盒说明(南京建城生物技术有限公司，南京，中国)。

使用TRIzolReagent(Invitrogen公司，Carlsbad,CA,USA)从皮肤组织中分离总RNA。采用SuperScriptFirstStrandcDNASystem进行逆转录，采用LightCycler480Real-TimePCRSystem进行qRT-PCR。

2.4.统计分析

所有数据采用独立样本进行统计分析t-使用SPSS22.0统计软件进行检验。

3.结果

3.1.伤口愈合

3.1.1临床伤口评估

图2显示，在第3天和第21天，富氢水组和蒸馏水组的皮肤创面面积存在显著差异。第3天，蒸馏水组皮肤创面出血、水肿、炎症反应明显，富氢水组皮肤创面不明显。第7天，富氢水组肉芽组织丰富，新生上皮细胞丰富，创面湿润光滑，而蒸馏水组肉芽组织和新生上皮细胞较少，创面干燥无光，血痂痂大，有炎性渗出物。第14天，所有犬的皮肤组织缺损均充满肉芽组织;富氢水组比蒸馏水组有更好的再上皮化，出现疤痕组织和毛发生长。第21天，富氢水组伤口几乎完全重新上皮化。第28天，富氢水组创面愈合完全，蒸馏水组创面愈合不完全。

图2实验组HRW和对照组DW不同时间损伤情况。

3.1.2。伤口愈合率和平均愈合时间

实验期间，蒸馏水组和富氢水组皮肤创面愈合率逐渐升高，直至完全愈合(图3,表2)。第3天，富氢水组皮肤创面愈合率(17.57±0.55%)显著高于蒸馏水组(1.59±0.55%)(p<0.05)。第7天，富氢水组皮肤创面愈合率(46.82±4.29%)显著高于蒸馏水组(16.44±6.43%)(p<0.01)。平均伤口愈合时间(图3B,表3)为(19.00±0.36d)，显著高于蒸馏水组(22.00±1.10d)(p<0.05)。

图3两组动物伤口愈合情况A和愈合时间B

3.2.组织病理学

3.2.1伤口长度

皮肤组织病理分析结果(图4)显示，在第7天，蒸馏水组和富氢水组创面长度仍较大，创面覆盖肉芽组织。第14天，富氢水组的皮肤创面长度明显小于蒸馏水组，并显示出更好的再上皮化(p<0.05)。

图4HE染色显示皮肤损伤长度

3.2.2愈合情况

富氢水组沿创面边缘可见新上皮形成，角化细胞分化、表皮细胞分化、表皮发育、皮肤发育、角化。第14天，蒸馏水组出现未分化角质形成细胞。第21天，富氢水组上皮平坦度、腺体形成和上皮厚度明显降低，而蒸馏水组上皮厚度不规则(图5A)富氢水组在第28天完成再上皮化，出现结缔组织，表明瘢痕组织的出现。第14天，富氢水组的平均表皮厚度(153.42±31.72μm)显著低于蒸馏水组(193.28±45.80μm)(p<0.05;图5B).第21天，富氢水组的平均表皮厚度(54.16±2.53μm)显著低于蒸馏水组(123.54±46.14μm)(p<0.01)。第28天，所有皮肤创面均愈合，富氢水组与蒸馏水组平均表皮厚度无显著差异。

图5HE染色显示两组动物不同阶段皮肤损伤病理改变特征。

3.2.3新血管形成

富氢水和蒸馏水组的新生血管结构在第7天达到最大值，但随着时间的延长新生血管结构逐渐减少(图5A、C、表4)。第7天，富氢水组新生血管结构数目(17.60±1.14)明显高于蒸馏水组(8.60±2.97)(p<0.01)。第21天，富氢水组新生血管结构数(1.20±0.84)与蒸馏水组(3.20±0.81)比较，差异有统计学意义(p<0.01;图5C,表4)。

3.2.4。胶原蛋白纤维

Masson三色染色后，胶原纤维染色为蓝色，肌纤维染色为红色。病理切片结果显示，两组的胶原纤维随着时间的推移而增加(图6)。富氢水组的胶原纤维在第21天正常配置，直到第28天与健康皮肤相似。蒸馏水组在第7~21天胶原纤维呈交错和不规则分布，少于富氢水组。第28天，蒸馏水组出现致密的不规则胶原纤维沉积。

图6Masson染色结果

图7氧化指标数据(略)

图8PCR分析结果(略)

3.3.氧化应激检测

实验期间，小鼠皮肤组织(图7一个,表5)先升高(第7~14天)，后降低(第14~28天)。第7天，蒸馏水组皮肤组织MDA水平(31.05±4.51U/mg)明显低于富氢水组(17.68±2.48U/mg)(p<0.01)。第14天，蒸馏水组MDA水平(41.40±2.74U/mg)显著高于富氢水组(17.47±2.82U/mg)(p<0.01)。第21~28天，皮肤组织中MDA水平急剧下降，两组间无显著差异(p>0.05)。

实验期间，小鼠皮肤组织(图7B,表6)从第7天开始升高至第28天，而富氢水组则先降低(第7天至第14天)后升高(第14天至第28天)。第7天，蒸馏水组皮肤组织SOD水平(12.36±0.96U/mg)明显高于富氢水组(22.82±1.57U/mg)(p<0.05)。第21天，蒸馏水组SOD水平(23.36±4.04U/mg)显著低于富氢水组(31.23±6.13U/mg)(p<0.05)。第28天，蒸馏水组SOD水平(24.39±2.87U/mg)显著低于富氢水组(33.78±7.11U/mg)(p<0.05)。

Nrf-2基因在富氢水/蒸馏水比值中的表达在第7~21天差异显著，在第14天差异显著(图7C)。HO-1基因在富氢水/蒸馏水比值中的表达在第7天和第21天有显著差异(图7D)。NQO-1基因在富氢水/蒸馏水比值中的表达在第7天和第21天有显著差异，在第14天有显著差异(图7E)。

3.4.生长因子检测

富氢水/蒸馏水比值中VEGF基因表达在第7天和第14天有显著差异(图8A)。PDGF在富氢水/蒸馏水比值中的基因表达在第7天和第14天也有显著差异(图8B)。

4.讨论

在本研究中，我们确定了富氢水治疗对狗的皮肤伤口愈合的积极作用，这主要归因于其抗氧化潜力。皮肤伤口愈合的金标准评估包括肉眼检查伤口表面的上皮和皮肤伤口大小随时间的减少。最近的研究表明，雌激素可能在分子水平上参与创面愈合过程。因此，在这项研究中使用的狗都是完整的雄性，以避免不同水平的雌激素。富氢水治疗方案在第7天至第28天显示出实质性效果;皮肤创面面积均小于蒸馏水组。氢水发现促进肉芽组织的快速形成比蒸馏水组缩短恢复时间,这可能是由于富氢水促进血管的形成在伤口愈合的早期阶段和相对快速愈合的。在这里，富氢水上调抗氧化基因和生长因子基因的表达，促进伤口愈合。此外，在第7-14天，富氢水组创面长度也明显短于蒸馏水组(图4)。

胶原纤维是细胞外基质的主要成分，在组织中起结构支架的作用，在皮肤创面愈合过程中调节细胞增殖和迁移。因此，胶原纤维的含量是检测皮肤创面愈合的重要参数。氢水组织表明,皮肤内的胶原纤维伤口网站观察更常规和更高的内容相比蒸馏水组(图6)从天7和21日。调节基因表达在PDGF刺激胶原蛋白合成和胶原酶的释放(图8b)。因此，PDGF基因表达升高导致富氢水组胶原纤维数量多于蒸馏水组。这也解释了为什么富氢水治疗后皮肤组织中的胶原纤维增加，可能是富氢水介导的皮肤伤口愈合的主要原则之一。

在皮肤创面愈合的早期阶段，炎症反应随后创面区域再次上皮化，肉芽组织的建立伴血管新生。新生血管对伤口愈合和组织修复也很重要。新生血管为伤口提供营养和氧气，支持角质形成细胞迁移，将间充质干细胞运送到皮肤，然后支持伤口再生。血管生成是一个由多种血管生成因子共同协调的过程，其中VEGF是调节血管生成过程关键步骤[36]的重要生长因子。同时，PDGF通过招募周细胞调节血管生成，促进皮肤创面愈合。在我们的实验中,VEGF基因表达的(图8),PDGF(图8b)两组表明,氢水组织表现出增强的能力为新血管形成的早期阶段的皮肤伤口愈合(鹿)和符合的结果的新生血管性组织切片(表4图5a、C)。因此,富氢水对皮肤创面血管生成的影响可能是通过增加VEGF和PDGF的表达，促进肉芽组织的形成来调控的。研究表明，VEGF在软骨内骨形成的早期阶段增加软骨形成，导致骨形成和骨愈合[38]显著增强。Fan等发现在子宫内膜修复中，VEGF阻断显著抑制了再上皮化。VEGF表达升高可促使皮肤创面再上皮化。因此，VEGF基因表达升高和血管新生是皮肤创面愈合过程中的积极信号。

Nrf-2是抗氧化反应的重要调节因子，可避免氧化损伤和氧化应激的发生。MDA是氧自由基对不饱和脂肪酸脂质过氧化作用的代谢物，间接反映了自由基损伤的严重程度。MDA水平的变化反映了组织中氧自由基含量的变化。SOD作为自由基的清除剂，其活性也反映了自由基[41]的数量。富氢水的抗氧化作用对促进伤口愈合至关重要。在本研究中，我们发现富氢水可激活Nrf-2抗氧化途径，并影响狗皮肤组织中SOD活性和MDA水平。

NQO-1和HO-1基因是Nrf-2的下游靶点，这两个基因受Nrf-2表达的调控，被认为是细胞内最重要的抗氧化机制之一.研究表明，氢分子可以激活肺组织中Nrf-2的表达，从而促进HO-1和NQO-1的表达.在我们的研究中，富氢水处理增加了Nrf-2的表达(图7C，第7天至第21天)，然后上调其下游II期代谢酶HO-1(图7D，第7至21天)和NQO-1(图7E，从第7天到第21天)。Nrf-2可以触发SOD的转录，降低皮肤组织中MDA的含量.本试验第7~14天，蒸馏水组MDA含量显著高于富氢水组(p<0.01)，且富氢水组SOD活性显著高于蒸馏水组(p<0.05)。MDA作为氧化反应中间体之一，是脂肪酸氧化的标志;它的水平升高可能导致老鼠皮肤伤口受损和延迟愈合.Li等发现创伤脂质过氧化和SOD表达的增强促进了慢性溃疡创面愈合.在糖尿病模型中，创面微环境中促炎细胞因子和氧化应激的增加导致创面愈合延迟.这说明SOD的活性反映了皮肤组织的氧化水平，较低的氧化水平可以避免氧化损伤，导致更快的愈合。Ohsawa等报道动物吸入2%氢气可清除羟自由基(OH)和过氧亚硝酸盐阴离子(ONOO-)，从而改善氧化应激诱导的细胞损伤.SOD可以催化超氧阴离子分解为氧和过氧化氢，这一步也需要氢的参与。富氢水为SOD提供更多的氢，参与氧自由基的清除;因此，富氢水通过增强SOD活力，清除羟自由基和超氧自由基，从而降低MDA含量，促进皮肤创面愈合。

5.结论

口服富氢水可增加肉芽组织血管数量，加速创面上皮形成，缩短创面愈合时间。富氢水可以增强狗的抗氧化能力，激活Nrf-2信号通路的表达，提高MDA、VEGF、PDGF的表达，降低SOD的表达。这些狗在遵循治疗策略时没有表现出不适。这些结果表明，富氢水是一种安全、有效的兽医临床治疗犬皮肤伤口的方法。

该研究来自东北农业大学兽医学院。

QiDD,DingMY,WangT,et al.TheTherapeutic Effectsof Oral In take of Hydrogen  Rich WateronCut aneous Wound Healingin Dogs[J]. Veterinary Sciences,  2021,8(11):264.

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